KINDERGARTEN今天推送的文章是发表在ACSCatalysis上的“StructuralInsightintoaMetal-DependentMutaseRevealinganArginineResidue-CovalentlyMediatedInterconversionbetweenNucleotide-BasedPyranoseandFuranose”，通讯作者是来自中国科
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今天推送的文章是发表在ACS Catalysis上的“Structural Insight into a Metal-Dependent Mutase Revealing an Arginine Residue-Covalently Mediated Interconversion between Nucleotide-Based Pyranose and Furanose”，通讯作者是来自中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室的李青连研究员和京大学药学院、天然药物及仿生药物国家重点实验室马明研究员。
呋喃糖（五元环）通常比相应的吡喃糖（六元环）具有更差的热力学偏好性，但在自然界中呋喃糖却是细菌、真菌、植物中细胞壁和果胶等的重要结构单元(图1A，B)，比如呋喃半乳糖是细菌细胞壁多糖的组成单元，而呋喃阿拉伯糖是植物果胶的组成单元。除了作为初级代谢产物的结构单元外，呋喃糖还是一些重要天然产物的生物合成原料，比如呋喃半乳糖和呋喃岩藻糖分别是抗生素A201A和hygromycin A的生物合成单元(图1C)。
图1
已知，呋喃糖可由变位酶通过其对应的吡喃糖环收缩而产生，这些变位酶催化基于核苷酸的吡喃糖和呋喃糖之间的相互转化，通常在达到平衡时以吡喃糖形式为主。
两种类型的变位酶已被表征：以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅因子的黄素依赖变位酶，和需要二价阳离子的金属依赖变位酶。黄素依赖变位酶包括UDP-D-呋喃生物合成中的UDP-吡喃半乳糖变位酶(UGM)，UDP-N-乙酰呋喃半乳糖生物合成中的UDP-N-乙酰吡喃半乳糖变位酶(UNGM)和GDP-6d-D-altro-heptofuranose生物合成中的GDP-6d-D-altro-heptopyranose变位酶(GaHM)。UGM、UNGM和GaHM的晶体结构表明，它们都有一个保守的三结构域折叠。金属依赖的变位酶包括UDP-L-阿拉伯呋喃糖生物合成中的UDP-阿拉伯吡喃糖变位酶(图1B)。与蛋白质数据库中公布的50多个FAD依赖的变位酶结构相比，迄今还没有确定金属依赖的变位酶的结构，其催化机制仍然难以捉摸。
作者之前破译了核苷类抗生素A201A的生物合成途径，并鉴定了一种变位酶MtdL，它在A201A生物合成中催化GDP-β-L-吡喃半乳糖生成GDP-α-L-呋喃半乳糖(图1C)。还发现MtdL可以催化GDP-α-L-呋喃岩藻糖和GDP-β-L-吡喃岩藻糖之间的相互转化，扩大了其在呋喃糖合成中的应用。MtdL在功能上是一种UGM，但它不是一种黄素依赖的变位酶，而是一种金属依赖的变位酶，它使用二价阳离子(Mn2+或Mg2+)作为辅因子，并且与UAMs的序列相似。在这里，作者确定了apo-MtdL和MtdL-GDP-Mg2+络合物的晶体结构，提出了金属依赖的吡喃糖-呋喃糖变位酶的第一个结构范例。
MtdL具有与黄素依赖变位酶不同的结构折叠和催化活性部位。定点突变和LC-MS/MS蛋白质组学分析揭示了吡喃糖-呋喃糖相互转化过程中通过共价精氨酸催化的机理。
作者获得了一个分辨率为2.30?的MtdL晶体结构。MtdL的结构呈Rossmann折叠，其特征为“α/β/α”三明治(α1?α6、α9和α10；β1?β3、β7、β9和β12)。除了这个“α/β/α”三明治，MtdL还包含额外的结构区，由α7、α8、α11?α13、β4?β6、β8、β10和β11组成(图2A)。
图2
MtdL中的Rossmann折叠和两个附加区组成了一个不同于所有其他酶的一般结构。DALI服务器的结构比对表明，MtdL与糖基转移酶(GT)的结构相似性很低，特别是那些拥有GT-A折叠的GT，这是因为这些GT共享Rossmann折叠。MtdL的DALI序列的最高同源物是分枝杆菌细胞壁生物合成中的呋喃半乳糖基转移酶GlfT2(图2B)，但相似性仍然很低，RMSD为3.3?，Z分数为15.6。
MtdL和GlfT2的叠加表明，它们之间唯一的同源区域是罗斯曼式的“α/β/α”三明治，其他区域显示出显著的差异(图2C)。毫不奇怪，MtdL与UGM、UNGM和GaHM的结构没有同源性，它们的结构共享一个保守的三结构域结构(图2D)。MtdL与这些FAD依赖的变位酶的不同结构表明MtdL通过不同的机制催化吡喃糖和呋喃糖之间的相互转化。
为了研究MtdL的催化机理,作者以apo-MtdL为搜索模型，通过分子置换确定了MtdL与GDP和Mg2+的络合物结构(命名为MtdL-GDP-Mg2+)，分辨率为2.27?(图2e)。MtdL-GDP-Mg2+的整体结构与MtdL有很高的相似性，对于C-α原子的RMSD为0.5?(图2F)。GDP的鸟苷部分与Thr13、Asp40、ASN42和Asp110形成氢键，鸟苷被Ile15和Asp87夹在中间形成疏水相互作用。二磷酸基团与Arg257形成氢键并配位Mg2+，Mg2+进一步与Asp109、Asp111和His287相互作用(图3A)。Asp109和Asp111属于所谓的DXD基序，这也是在UAMs和GT-A结构中保守的二价阳离子配位。Ile15、Asn42、Asp110、Asp111和His287在MtdL-GDP-Mg2+和MtdL之间可以观察到不同的侧链构象，与GDP和Mg2+的结合一致(图3A)。
图3
在GT-A结构中，有一个覆盖活性部位并被认为与糖受体底物相互作用的“环1”(图3B)。在MtdL-GDP-Mg2+中也观察到这个“环1”，但由于螺旋α8的存在、螺旋α8之前和之后的环以及链β5和螺旋α7之间的环的存在而被推向GDP分子(图3C)。这些螺旋和环，特别是MtdL中Arg159靠近GDP的二磷酸基(图3C)，只在GDP周围形成一个小空间，与GTs中糖受体结合的这个大空间不同(如GlfT2，图3B)，从而证明了MtdL和GTs之间的不同功能。
作者在解决MtdL-GDP-Mg2+结构时使用底物GDP-β-L-岩藻糖制备了复杂的晶体，但由于缺乏电子密度，无法形成岩藻糖部分。随后尝试了GDP-β-L-岩藻糖与MtdL突变体包括MtdLD109A和MtdLR159A的共结晶或浸渍，但经过巨大的努力仍然无法获得复杂的结构。由于GDP在MtdL-GDP-Mg2+结构中已经被很好地定义，作者根据GDP的位置将底物GDP-β-L-岩藻糖模拟到MtdL的活性中心，并进行了分子动力学(MD)模拟研究其催化机理。
GDP-β-L-吡喃岩藻糖分子动力学模拟结果表明，β-L-吡喃岩藻糖基与MtdL-GDP-Mg2+结构中的GDP基团位置相似，与Arg90、Gln229、Arg257形成氢键作用。β-L吡喃岩藻糖部分的异构碳(C1)非常接近Arg159(3.4?)，这也与Asp260形成了氢键(图4A)。已知黄素依赖的变位酶通过形成共价连接的Fad-亚胺离子中间体来催化吡喃糖-呋喃糖的相互转化。鉴于Arg159与β-L-吡喃岩藻糖部分的C1位置很近，推测Arg159可能起到与FAD类似的作用；即Arg159攻击β-L-吡喃岩藻糖部分的C1实现SN2亲核取代，GDP基在Arg257的帮助下离开(图4A)。对Arg159共价α-L-吡喃岩藻糖的分子动力学模拟表明，吡喃岩藻糖与Arg90、As195和As260形成氢键，Asp195被提出质子化岩藻糖的醚环氧原子(距离3.5?)(图4B)，打开吡喃岩藻糖环并在C1和Arg159的侧链氮之间形成亚胺双键(图4C)。对这种Arg159-共价线性中间体的MD模拟表明，糖部分与Arg90、Asp195和Asp260形成氢键，C4羟基被Asp260激活以攻击C1(图4C)。有趣的是，C4羟基只从亚胺双键的一个方向攻击C1(图4C)，生成Arg159共价的β-L-呋喃岩藻糖产物(图4D)。对Arg159共价β-L-呋喃岩藻糖的分子动力学模拟表明，呋喃岩藻糖部分与Asp195、Gln229和Asp260形成氢键，GDP被Arg257激活，攻击β-L呋喃岩藻糖部分的C1，实现另一个SN2亲核取代，再次转化C1构型，生成GDP-α-L-呋喃岩藻糖产物(图4D)。
图4
以GDP-β-L-吡喃岩藻糖为底物，通过定点诱变和体外催化验证了上述相互作用残基的作用，结果表明，这些残基(Arg90、Asp195、Gln229、Arg257、Asp260)突变为丙氨酸后，除MtdLQ229A突变体保持弱活性外，其余均丧失催化活性(图5A)。Arg159突变为丙氨酸，以及其他碱性残基，如赖氨酸和组氨酸，也丧失了活性。有趣的是，当作者增加底物浓度(增加10倍)和酶浓度(增加100倍)时，MtdLR159H的活性很弱。这可能是因为组氨酸可以像精氨酸一样与底物形成共轭亚胺双键，从而促进中间转化。为了确证Arg159共价结合底物的催化模式，将MtdL与底物孵育后用胰蛋白酶水解，再用质谱蛋白组学方法进行了分析。结果表明一个含有Arg159的肽段给出了一系列碎片离子，均清晰地指向底物共价结合在Arg159上，从而佐证了MtdL的催化机制(图5B)。
图5
为了研究Arg159在其他金属依赖的变位酶中是否保守，作者将MtdL与Hyg20(潮霉素A生物合成中的吡喃岩藻糖-呋喃岩藻糖变位酶)和已知的UAMs进行比对，其中包括OsUAM1(包含先前报道的糖基化精氨酸)、OsUAM3、AtRGP1、AtRGP2、AtRGP3及其同源物(这些酶与MtdL之间的序列同源性在25%到61%之间)。结果表明，Arg159以及其他活性位点残基Arg90、Asp195、Arg257和Asp260在这些酶中是保守的，表明它们可能共享类似的精氨酸共价催化作用。
综上所述，作者确定了金属依赖的吡喃糖-呋喃糖变位酶MtdL的apo结合形式和GDP结合形式的第一结构。结构分析和分子动力学模拟揭示了催化过程中的关键残基。定点突变和LC-MS/MS蛋白质组学分析证实了精氨酸共价连接的催化机理。尽管精氨酸残基被发现参与许多酶反应，但它们通常通过形成氢键或盐桥而不是形成底物共价中间体来发挥作用。例如肌酸激酶、腺苷酸激酶、F1-ATPase、醋酸激酶、蛋白酪氨酸磷酸酶和某些GTP酶激活蛋白(GAP)，利用精氨酸残基与磷酸根形成两个氢键，促进磷酸转移反应。精氨酸共价介导的反应很少见报道。本研究对精氨酸残基在酶促反应中的作用机制进行了研究。鉴于MtdL与其他金属依赖变位酶的序列相似性和保守的催化精氨酸残基，该研究结果为更好地理解金属依赖变位酶的催化作用提供了更好的依据，并有助于它们在呋喃糖代中的应用。
END
文章信息：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.2c04907?ref=pdf
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